Lon蛋白酶的“5+1”組裝-激活機(jī)制

Lon蛋白酶是一種高度保守的AAA+蛋白酶，存在于細(xì)菌、古菌和真核細(xì)胞器中。它在蛋白質(zhì)降解、蛋白質(zhì)質(zhì)量控制、粒線體基因表達(dá)、應(yīng)激響應(yīng)以及其他細(xì)胞事件中都扮演著重要的角色。研究表明Lon與致病細(xì)菌毒力和腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，已成為近年來抗菌和抗癌策略的新靶標(biāo)。

Lon的單體具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域（N端結(jié)構(gòu)域、AAA+域和蛋白酶域），它通過形成同源六聚體行駛功能。Lon的蛋白水解活性位點(diǎn)位于六聚體的中空腔室中，底物只能通過狹窄的軸向孔進(jìn)入。張凱銘/李珊珊團(tuán)隊(duì)近年來一直致力于Lon蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能研究，闡明了其N端結(jié)構(gòu)域如何識(shí)別底物并使底物去折疊（Sci Adv. 2021a）、ATP酶結(jié)構(gòu)域如何促使底物易位將其送入桶狀降解室（J Biol Chem. 2021）、底物在降解室里如何被水解并作為肽產(chǎn)物釋放（Sci Adv. 2021b）。然而， Lon功能性六聚體的組裝過程仍然未知。

2023年11月13日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)張凱銘/李珊珊團(tuán)隊(duì)和臺(tái)北中央研究院張崇毅團(tuán)隊(duì)合作在Nature communications雜志發(fā)表題為“A 5+1 assemble-to-activate mechanism of the Lon proteolytic machine”的文章。這項(xiàng)新的研究展示了Lon AAA+蛋白酶的激活過程，包括五聚體組裝和依賴底物的第六個(gè)單體插入形成激活態(tài)。

在本次工作中，中科大副研究員李珊珊等人解析了一系列從無底物狀態(tài)到底物結(jié)合狀態(tài)的Lon結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)使得研究人員能夠識(shí)別和觀察不同的組裝中間體中每個(gè)單體的結(jié)構(gòu)變化。研究揭示了Lon蛋白酶的螺旋性五聚體的重要作用：在沒有底物的情況下，第六個(gè)單體會(huì)結(jié)合到螺旋五聚體的最低位置，形成具有受阻孔環(huán)的自抑制螺旋六聚體。然而，當(dāng)?shù)孜锎嬖跁r(shí)，第6個(gè)單體的結(jié)合會(huì)形成閉合環(huán)六聚體，這反過來又打開了蛋白水解槽。因此，在Lon蛋白酶的組裝過程中，五聚體與第6個(gè)單體底物依賴性的結(jié)合，激活了眾所周知的底物-孔環(huán)接觸的形成，最終形成了功能性六聚體。

為了驗(yàn)證這一“5+1”激活模型，研究人員構(gòu)建了Lon的單體突變體（?N-E613K和?N-L708R），這些單體突變體可以與五聚體形式結(jié)合形成螺旋性六聚體而無法形成功能性六聚體，以濃度依賴的方式完全抑制野生型Lon對(duì)底物的降解。這些結(jié)果表明，螺旋五聚體，而不是螺旋六聚體，是介導(dǎo)Lon底物依賴性激活的關(guān)鍵介質(zhì)。進(jìn)一步的研究表明，這些突變體在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)，導(dǎo)致了與Lon缺乏相關(guān)的特定表型變化，包括抑制持久性細(xì)胞的形成。因此，通過一系列體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究人員證明了這種“5+1” 組裝-激活機(jī)制的功能和生物學(xué)意義。

綜上，這些研究發(fā)現(xiàn)為AAA+蛋白酶的激活機(jī)制提供了一個(gè)新的范例，該激活機(jī)制是由底物控制的組裝過程誘導(dǎo)的，其中五聚體的中間狀態(tài)在組裝過程中起著至關(guān)重要的作用。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞內(nèi)蛋白水解機(jī)器是如何受到底物存在的嚴(yán)格控制的，如果不受控制，它將具有潛在的破壞性。最后，這項(xiàng)工作還展示了一種抑制細(xì)胞內(nèi)特定AAA+蛋白的新策略，從而阻礙大腸桿菌持久性細(xì)胞的形成。這些結(jié)果可能為靶向抑制細(xì)胞中特定 AAA+ 蛋白的治療應(yīng)用開辟新途徑。

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