新研究揭示Rpd3S/HDAC結合和催化核小體底物的分子機制

組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases，HDACs)是進化上保守的酶，可以去除組蛋白上的乙酰化修飾，并在表觀遺傳基因沉默中發揮核心作用[1]。HDACs大家族根據與酵母中序列同源性和結構域組織差異可分為四類，其中I類HDAC被廣泛研究，因為其是多種疾病（癌癥、炎癥、感染和神經系統疾病等）的表觀遺傳治療非常有希望的靶點[2]。釀酒酵母中的Rpd3是I類HDAC的創始成員，它在體內可以形成兩種不同的復合物:在啟動子區域去乙酰化組蛋白的~ 1.2 MDa Rpd3L，以及靶向轉錄區域抑制基因轉錄起始的~ 0.6 MDa Rpd3S[3,4]。Rpd3S由三個核心蛋白：Rpd3、Sin3和Ume1以及兩個染色質結合亞基：Eaf3和Rco1組成[5,6]。在高等真核生物中，額外的組成亞基以及類似物和異構體的存在進一步增加了HDAC復合物的異質性，限制了我們對這些復合物結構和功能的理解。

2023年10月16日，中國科學技術大學生命科學與醫學部王雪娟、蔡剛教授團隊合作在Cell Research（IF=44）期刊上在線發表了題為Structural basis for nucleosome binding and catalysis by the yeast Rpd3S/HDAC holoenzyme的研究論文。該研究利用冷凍電鏡技術解析了Rpd3S/HDAC全酶復合物結合H3K36me3修飾核小體底物復合物的高分辨結構，**清晰捕獲了結合在Rpd3S/HDAC活性中心的天然催化底物--組蛋白H3尾部（1-24氨基酸殘基），并意外地發現了H3K18殘基的側鏈對準HDAC催化殘基等待催化；并通過功能手段進一步驗證了結構上的發現，尤其是Rco1亞基N端結構域在核小體底物結合和活性精準調控中起到的關鍵作用。

早在2005年Jerry Workman團隊已經清晰鑒定了Rpd3S復合物的5種亞基組成[3]，但是由于其整體蛋白分子結構柔性較大，為其高分辨結構的解析帶來了很大的難度。酵母Rpd3S復合物相關結構及其人類同源物Sin3B復合物的結構直到近期才被報道[7-9]。然而，Rpd3S如何識別和催化底物，及其HDAC活性精細調控的結構基礎和分子機制尚不清楚。

為了回答這個重要的科學問題，該研究團隊首先通過大規模培養酵母細胞和內源性蛋白純化獲得了高度均一的Rpd3S復合物蛋白，優化并組裝了**單核小體底物（H3K36me3修飾；僅在核小體一端伸出70bp linker DNA）。在不引入任何化學交聯劑干擾的情況下，成功體外組裝了Rpd3S-核小體復合物，解析了3.7 ?分辨率的復合物結構。

該結構揭示了Rpd3S包含兩個Rco1和兩個Eaf3拷貝，它們通過Rco1 C-端卷曲區域（CC）進行二聚化，Eaf3 CHD結構域識別H3K36me3標記并與核小體DNA相互作用。Sin3作為支架蛋白和Rco1亞基一起協調了復合物的組裝，并通過其HID、MD和CTD結構域包裹住催化亞基Rpd3；同時，Sin3-DNA、Rco1-linker DNA結合界面共同幫助引導Rpd3S精準錨定在核小體底物上。

Rco1 N端的ABR結構域通過R61和K64殘基直接錨定在組蛋白的酸性斑塊的表面，并通過R50和R51殘基在SHL -6.5處與核小體DNA結合。此外，Rco1 PHD1結構域的D261側鏈直接與H3K4me0相互作用、參與底物的識別；而Rco1 PHD2結構域與Rpd3相互作用參與復合物整體結構的組裝和穩定。

H3K18Ac是癌癥進展的重要標志，也是抗癌治療的潛在靶點[10]，該結構**解析了完整的天然底物H3尾巴（1-24 aa）結合在活性中心的結合狀態，并且H3K18殘基朝向催化中心。這些結構上的重要發現，被體外的功能實驗進一步地得到證實。

該研究報道了Rpd3S全酶結合和催化核小體底物的結構基礎，清晰揭示了Rpd3S全酶底物識別特異性和催化復雜性，闡明了Rpd3S通過構象變化實現組蛋白多位點催化的機制，為研制高特異性Rpd3S/Sin3B抑制劑用于癌癥治療提供了新的靶點。

這項工作是在中國科學院戰略先導B專項和國家自然科學基金項目的資助下完成的；中國科大生醫部王雪娟教授和蔡剛教授為該論文的共同通訊作者，博士生張躍躍和博士后徐夢雪為該論文的共同**作者，研究生王坡、周佳慧、王光顯和韓帥龍參與了部分工作。數據收集在中國科學技術大學冷凍電鏡中心完成。此外，該研究還得到了清華大學李海濤、陳柱成教授，中國科大臧建業、施蘊渝教授的大力幫助。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41422-023-00884-2

參考文獻

1. Goldberg, A. D., Allis, C. D. & Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell 128, 635-638 (2007).

2. Luo, Y. & Li, H. Structure-Based Inhibitor Discovery of Class I Histone Deacetylases (HDACs). Int J Mol Sci 21 (2020).

3. Carrozza, M. J. et al. Histone H3 methylation by Set2 directs deacetylation of coding regions by Rpd3S to suppress spurious intragenic transcription. Cell 123, 581-592 (2005).

4. Keogh, M. C. et al. Cotranscriptional set2 methylation of histone H3 lysine 36 recruits a repressive Rpd3 complex. Cell 123, 593-605 (2005).

5. Chen, X. F. et al. The Rpd3 core complex is a chromatin stabilization module. Current biology : CB 22, 56-63 (2012).

6. Li, B. et al. Combined action of PHD and chromo domains directs the Rpd3S HDAC to transcribed chromatin. Science 316, 1050-1054 (2007).

7. Wan, M. S. M. et al. Mechanism of assembly, activation and lysine selection by the SIN3B histone deacetylase complex. Nature communications 14, 2556 (2023).

8. Wang, C. et al. Two assembly modes for SIN3 histone deacetylase complexes. Cell Discov 9, 42 (2023).

9. Guan, H. et al. Diverse modes of H3K36me3-guided nucleosomal deacetylation by Rpd3S. Nature (2023).

10. Halasa, M. et al. H3K18Ac as a Marker of Cancer Progression and Potential Target of Anti-Cancer Therapy. Cells 8 (2019).