PCR Clean?祛除RNases的效果檢測

科研人員測試了PCR Clean?（噴霧和預濕濕巾）祛除玻璃表面RNases的能力。

簡單地說，將RNase A（5μl，0.03 U/ml甘油，Thermo Fisher Scientific, Cat.No.AM1964）轉移到先前凈化過的玻璃表面上，并在室溫下孵育30分鐘。

接下來，用干燥紙巾、PCR Clean? Wipes或用含有70%異丙醇、PCR Clean?或市售的RNase去污劑RNaseZap?（Thermo Fisher Scientific, Cat.No.AM1964）的紙巾擦拭實驗點，15秒接觸時間后可重復擦拭。

在控制條件下進行RNase污染后，50μl無核酸酶的H₂O (Thermo Fisher Scientific, Cat； No.AM1964)添加到預污染點并上下移液10次以收集任何存在的RNase。

然后將這些樣品中的45μl用于市售的熒光檢測RNaseAlert?（Thermo Fisher Scientific, Cat.No.AM1964）。該試劑盒是按照制造商的建議使用的。隨后，在37°C孵育期間測量原始熒光（ex 490/em 520），最多每5分鐘一次。使用CFX96 Touch?（Bio-Rad） 2小時。

實驗結果，在表面清潔或未清潔后，使用市售的基于熒光的RNase活性測定來評估RNase的有效祛除。在分析之前，通過徹底的點移液對表面進行取樣，包括省略RNase（陰性對照）或擦拭（陽性對照）的表面，并用基于熒光的方法RNaseAlert?（ThermoFisher Scientific）進行分析。在未進行擦拭的樣品中，始終觀察到嚴重污染的RNase活性（圖6A，紫色曲線，代表性結果）。與陰性對照組一樣，當沒有測量到RNase的殘留活性時，認為凈化完成。

就熒光信號而言，根據試劑盒制造商的建議，將截止值定義為陰性對照熒光的2.5倍（圖6A，紅色虛線）。基于該參數，在至少2或3個重復實驗中，省略擦拭步驟、使用干紙巾或用70%異丙醇潤濕的毛巾不會抑制RNase的活性（表6和圖6）。為了更好地突出陰性對照和其他清潔方法之間的差異，圖6B中顯示了圖6A（黑色矩形）的相應縮放區域。只有在用PCR Clean?（預濕濕巾和浸濕的紙巾）或RNaseZap?浸濕的紙巾擦拭后，才能實現顯著和可重復的去污，即使在37°C下孵育2小時后，熒光水平也很低（圖6和表6）。