干貨分享：支原體檢測方法學(xué)驗證的通關(guān)秘籍

近年來，生物醫(yī)藥領(lǐng)域取得了飛速進(jìn)步，細(xì)胞治療等項目已成為該領(lǐng)域的焦點。與此同時，為確保生物制品的安全性和可靠性，各國法規(guī)及相關(guān)監(jiān)管機(jī)構(gòu)正不斷強(qiáng)化對其的監(jiān)督力度。其中，一個關(guān)鍵的問題就是“如何對生物制品進(jìn)行檢測，以確保產(chǎn)品的生物安全”。對于涉及細(xì)胞培養(yǎng)的生物制品生產(chǎn)工藝，各國法規(guī)均明確規(guī)定了相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)與要求。

歐洲藥典（EP）和日本藥典（JP）中規(guī)定的生物制品支原體檢測的方法主要包括以下幾種：培養(yǎng)法、染色法（指示細(xì)胞法）、核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）。由于方法自身的局限性，越來越多的生產(chǎn)企業(yè)選擇用NAT法替代培養(yǎng)法和染色法。但在藥典中明確指出，NAT法需要經(jīng)過方法學(xué)驗證，與傳統(tǒng)方法（培養(yǎng)法和染色法）進(jìn)行對比，對比項目包括特異性、檢測靈敏度等指標(biāo)，要求NAT法結(jié)果不低于傳統(tǒng)方法，才可以使用。

不同藥典在特異性（Specificity）、檢測限（Detection Limit）和耐用性（Robustness）三方面進(jìn)行了要求。

特異性：特異性指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）可能存在下，采用的檢測和分析方法能正確測定出待檢物種的能力。

檢測限：檢測限是指樣品中被測物能被檢測出的最低量。對需要進(jìn)行檢測限確認(rèn)的支原體類型，試劑盒廠家需盡可能多的覆蓋法規(guī)藥典中要求的支原體類型。

耐用性：耐用性是指，檢測條件有小的變動時，檢測結(jié)果不受影響的承受程度。比如，抑制物質(zhì)實驗可檢測實驗的耐用性。

藥典中規(guī)定如果NAT法用于替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，其檢測限需達(dá)到10CFU/ml（菌落形成單位/毫升）。這意味著，NAT法能夠檢測到每毫升樣品中至少10個支原體菌落。如果NAT法用于替代DNA染色法，其檢測限則需達(dá)到100CFU/ml。

為了確保NAT法的靈敏度達(dá)到這一標(biāo)準(zhǔn)，需要使用支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗證。這些標(biāo)準(zhǔn)品通常是凍干粉型的滅活支原體，涵蓋了藥典規(guī)定的所有支原體物種。通過將這些標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品一起進(jìn)行檢測，可以驗證NAT法的最低檢測限。

在實驗過程中，雖然可以通過在實驗室自行滅活購自菌種保藏中心（如ATCC或NCTC）支原體菌株的方法，制備得到支原體標(biāo)準(zhǔn)品，但通過該方法得到的滅活菌株標(biāo)準(zhǔn)品，批次間差異可能比較大，很難實現(xiàn)真正意義上的“標(biāo)準(zhǔn)化”，且每次制備都要進(jìn)行對標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性檢測，耗時耗力效果差，很難保障方法學(xué)驗證的順利推進(jìn)。

因此，大多數(shù)生物藥、細(xì)胞治療等產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)廠家，都會選擇商品化的支原體檢測標(biāo)準(zhǔn)品，批量化的高效生產(chǎn)，每批次的嚴(yán)格質(zhì)檢，專業(yè)的凍干技術(shù)，能夠幫助相關(guān)工業(yè)生產(chǎn)企業(yè)順利完成方法學(xué)驗證。

以常用的德國Minerva Biolabs的10CFU支原體檢測限標(biāo)準(zhǔn)品為例，這類符合藥典的商品化標(biāo)準(zhǔn)品，都具備以下特點：

符合歐洲藥典（EP）和日本藥典（JP）方法學(xué)驗證要求。

所有菌株都在低傳代中培養(yǎng)，支原體在對數(shù)生長期收獲，經(jīng)測定，確保GU與CFU的比率符合要求，可溯源至ATCC、NCTC同序列號的菌株。

全面覆蓋：涵蓋了歐洲藥典和日本藥典規(guī)定的所有支原體物種（見下表），用于支原體核酸擴(kuò)增法（PCR/qPCR）的方法學(xué)驗證。商品化標(biāo)準(zhǔn)品通常涵蓋了歐洲藥典和日本藥典規(guī)定的所有支原體物種，用于支原體核酸擴(kuò)增法（PCR/qPCR）的方法學(xué)驗證（檢測限和耐用性驗證），無需實驗室自行篩選和制備。

即用型產(chǎn)品：商品化標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過嚴(yán)格的制備和質(zhì)量控制，可以直接用于方法學(xué)驗證，無需額外的處理或優(yōu)化步驟，提高了驗證的效率和便捷性。

提供詳細(xì)文檔：商品化標(biāo)準(zhǔn)品通常附有詳細(xì)的分析證書（COA），提供該批次GU:CFU比值（支原體基因組/菌落數(shù)比值）等信息，有助于實驗室更好地了解和使用標(biāo)準(zhǔn)品。

采用凍干科技，凍干粉形式使產(chǎn)品更穩(wěn)定、儲存成本更低、運(yùn)輸更便捷。

產(chǎn)品線齊全，從支原體提取試劑盒、支原體qPCR檢測試劑盒、支原體基因組DNA、經(jīng)滅活PCR絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品需全覆蓋，一站式解決支原體方法學(xué)驗證問題。

商品化的10CFU支原體檢測標(biāo)準(zhǔn)品在質(zhì)量穩(wěn)定性與可靠性、驗證效率與便捷性、安全性與合規(guī)性等方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，更有利于實驗室進(jìn)行方法學(xué)驗證。