研究發現，RNA適配體RhoBAST結合與激活熒光團TMR-DN的機制

在活細胞中對生物大分子，如蛋白質和RNA等進行時空定位和追蹤，對于理解它們的生物學功能和揭示其機制至關重要。綠色熒光蛋白的發現和開發顯著提高了活細胞內功能性蛋白成像的適用性。目前，熒光點亮RNA適配體 (FLAP) 已作為熒光蛋白的對應物應用于細胞中功能RNA的成像。FLAP通常是利用體外進化篩選技術得到的一段RNA序列，其結合配體后能顯著增強配體的熒光。由于其高亮度、更好的可編程性和較小的尺寸，FLAP被認為是強有力的活細胞RNA熒光成像工具。

近年來，RhoBAST、biRhoBAST、o-Coral、SiRA等一系列FLAP因其在RNA超分辨率成像中的優異表現而受到廣泛關注。這些FLAP均可結合羅丹明的衍生物。羅丹明是一種熒光染料，以超高的光穩定性、亮度和良好的膜滲透性而廣泛用于生物成像。研究表明，RhoBAST可以結合并激活一種接觸淬滅型羅丹明衍生物TMR-DN (發光團TMR和淬滅劑DN的耦聯化合物)，因其良好的折疊性能、高親和力、配體快速交換、超高亮度、優異的光穩定性等多種特征，在RNA的超分辨率成像中表現出優異的性能。然而，RhoBAST結合和激活熒光染料的結構機制還不清楚。

2024年5月17日，中國科學院生物物理研究所方顯楊研究組與動物研究所李幸研究組合作在《Nature Communications》上發表了題為"Structural mechanisms for binding and activation of a contact-quenched fluorophore by RhoBAST"的研究論文。在該項研究中，研究人員通過整合X射線晶體學、小角X射線散射、分子動力學模擬等方法，揭示了RhoBAST的結構及其結合與激活TMR-DN的分子機制。

研究人員首先應用X射線晶體學解析了RhoBAST與TMR-DN復合物的高分辨率結構，發現RhoBAST折疊成一種四分支結構(four-way junction)，整體結構類似于不對稱的"A"字形(圖a)。TMR的蒽雜環嵌入到位于"A"字形頂端的半開放結合口袋，而DN堆積在TMR的苯環上。有趣的是，盡管TMR-DN與RhoBAST的相對結合面積普遍要小于絕大多數的FLAPs (圖b-c)，但是RhoBAST與TMR-DN卻有著較高的親和力(K_D ≈ 30 nM)。小角X射線散射實驗表明RhoBAST的折疊不依賴于配體分子，這顯著區別于絕大數的FLAP結構，通常這些FLAP的折疊依賴配體的結合。通過與其它FLAP的折疊結構和結合模式的比較，研究人員推測,可能由于RhoBAST的結合口袋遠離折疊中心，因而其折疊不依賴配體。同時，這也賦予了RhoBAST結構的剛性，使其與TMR-DN的結合更像是鎖-鑰模式。類似的，一種識別花菁染料的適配體DIR2s也具有近似的結構特征(圖b)，也展示出不依賴配體結合的折疊模式。由于RhoBAST的結構剛性，它與配體結合過程中較少的構象熵損失彌補了它們之間相對較弱的相互作用，使其仍然具有較高的配體結合親和力。RhoBAST的結構剛性以及半開放的結構口袋的特征可能還賦予它與配體快速交換的動力學性能，其要比其它FLAPs如pepper系統至少快兩個數量級以上，因此可以通過與溶液中新鮮配體的快速交換來很好地避免光漂白問題，使其在熒光超分辨成像展現出優良的光學性質。

為了更好地理解RhoBAST對TMR-DN的激活機制，研究人員采用增強采樣的分子動力學模擬方法表征了TMR-DN在自由以及與RhoBAST結合狀態下的構象空間。結果表明，無論是自由還是結合狀態下，TMR-DN都呈現出一種高度動態的構象特征，其中接觸-非堆疊構象占據所有接觸類型中的多數(圖d)。未結合狀態下，淬滅劑DN與發光團TMR接觸比例達到90%，DN偏向與其中的蒽雜環接觸。此時絕大多數的TMR-DN處于自淬滅狀態(熒光量子產率 Φ_F=0.08)。與RhoBAST結合后，DN與蒽雜環的接觸被抑制，其與TMR的接觸比例顯著下降到60%左右，因此只有部分TMR-DN被激發，這與之前文獻報道該體系在結合狀態下只有中等熒光量子產率(Φ_F=0.57)的觀測是大致相符的。

總之，該項工作通過整合多種研究方法揭示了RhoBAST的結構及其結合與激活一種熒光淬滅型熒光團TMR-DN的機制，進一步通過比較相關FLAP的結構和結合模式，為理性設計和優化這一重要的FLAP系統提供了機制見解。

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