研究揭示人源鈉鈣交換蛋白NCX1的別構(gòu)抑制的分子機(jī)制

近期，中國科學(xué)院生物物理研究所趙巖研究組在《EMBO Journal》雜志在線發(fā)表題為"Structural insight into the allosteric inhibition of human sodium-calcium exchanger NCX1 by XIP andSEA0400"的研究論文。這項研究通過冷凍電鏡單顆粒技術(shù)重構(gòu)出人源NCX1.3結(jié)合特異性抑制劑SEA0400的高分辨結(jié)構(gòu)，揭示了XIP介導(dǎo)的自抑制機(jī)制和SEA0400的別構(gòu)抑制機(jī)制。

　鈉鈣交換蛋白（sodium-calcium exchange, NCX）屬于SLC（Solute Carrier）家族和CaCA（Calcium/Cation Antiporter）超家族，是一種雙向離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，可以通過正向和反向轉(zhuǎn)運(yùn)方式，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外Na離子和Ca²⁺的交換，對于維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。NCX參與體內(nèi)多種生理過程，例如心肌興奮-收縮耦聯(lián)，血壓調(diào)節(jié)、大腦長時程增強(qiáng)和神經(jīng)遞質(zhì)分泌等。在多種心腦血管疾病中存在NCX功能異常，如缺血再灌注損傷、腦卒中、新生兒缺血缺氧性腦病等。因此，NCX結(jié)構(gòu)的研究對于深入了解細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡調(diào)節(jié)機(jī)制、設(shè)計新型藥物治療策略以及探索與心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等相關(guān)的疾病機(jī)制具有關(guān)鍵意義。SEA0400是NCX1的選擇性抑制劑并且更傾向抑制NCX的逆轉(zhuǎn)運(yùn)模式，該模式負(fù)責(zé)攝取細(xì)胞外Ca²⁺。然而，它對逆向轉(zhuǎn)運(yùn)模式而非正向轉(zhuǎn)運(yùn)模式選擇性的分子基礎(chǔ)仍然未知。理解這種分子基礎(chǔ)對于合理開發(fā)特異性靶向NCX1逆模式的藥理抑制劑至關(guān)重要，這在預(yù)防缺血/再灌注損傷和心力衰竭背景下的Ca²⁺超載和電功能障礙方面具有很大的治療潛力。

通過冷凍電鏡單顆粒技術(shù)解析的野生型NCX1.3的高分辨結(jié)構(gòu)展示了其多個結(jié)構(gòu)域的組裝方式，包括兩個調(diào)控性鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD1和CBD2）與離子轉(zhuǎn)運(yùn)跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD）。其中CBD1深入胞漿，而CBD2位于細(xì)胞質(zhì)膜表面附近。CBD1和CBD2形成首尾串聯(lián)結(jié)構(gòu)，并形成約126°的夾角。TMD通過一個短螺旋與CBD2相連，位于跨膜螺旋中部的離子結(jié)合位點(diǎn)暴露向細(xì)胞內(nèi)側(cè)，因此可以判斷出當(dāng)前解析的結(jié)構(gòu)為內(nèi)開構(gòu)象。

在CBD2和TMD之間的凹槽中觀察到了交換抑制肽（the exchanger inhibitory peptide，XIP）的密度。之前的功能研究表明，XIP可以抑制NCX的活性并導(dǎo)致其失活，但其具體抑制機(jī)制一直不清楚。進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析顯示，XIP通過阻止門控螺旋TMs1/6的構(gòu)象變化，將NCX穩(wěn)定在內(nèi)向構(gòu)象并阻止其轉(zhuǎn)變?yōu)橥庀驑?gòu)象，從而抑制NCX的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。在結(jié)構(gòu)中觀察到了與XIP結(jié)合相關(guān)的關(guān)鍵相互作用，通過點(diǎn)突變及全細(xì)胞電生理實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)破壞這些相互作用會使XIP介導(dǎo)的失活被減弱。

細(xì)胞質(zhì)Ca²⁺不僅作為NCX的底物，還通過與細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域CBD1和CBD2的結(jié)合來調(diào)節(jié)NCX的活性。CBD1含有四個Ca²⁺結(jié)合位點(diǎn)。CBD2中Ca²⁺結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量由其互斥的外顯子A和B決定。含有外顯子A的CBD2有兩個Ca²⁺結(jié)合位點(diǎn)，而含有外顯子B的CBD2缺乏Ca²⁺結(jié)合位點(diǎn)。NCX1.3含有外顯子B，盡管NCX1.3的CBD2無法與Ca²⁺結(jié)合，結(jié)構(gòu)分析顯示CBD2與外顯子A的潛在Ca²⁺結(jié)合位點(diǎn)緊鄰XIP結(jié)合位點(diǎn)。在NCX1.3的結(jié)構(gòu)中，CBD2表現(xiàn)出負(fù)電荷的靜電表面，這有助于與帶正電的XIP區(qū)域結(jié)合。而Ca²⁺與含外顯子A的CBD2結(jié)合將中和這種負(fù)電勢，從而減少XIP區(qū)域的結(jié)合親和力，進(jìn)而可能導(dǎo)致XIP介導(dǎo)的失活減少甚至完全消除，這是胞內(nèi)Ca²⁺調(diào)控的機(jī)制。

選擇性抑制劑SEA0400主要阻斷NCX1，對NCX3幾乎沒有影響。在解析的結(jié)構(gòu)中，它結(jié)合到TM2ab周圍的一個變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)大多數(shù)殘基是保守的，除了一個苯丙氨酸在NCX3中被亮氨酸取代，功能實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)了這個殘基在亞型選擇性中的關(guān)鍵作用，為合理設(shè)計亞型特異性藥物提供了堅實(shí)的基礎(chǔ)。TM2ab與底物離子的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，SEA0400通過抑制TM2ab的構(gòu)象轉(zhuǎn)變來發(fā)揮抑制作用。此外，XIP與TM1-2 loop之間的相互作用也維持了TM2ab的特定構(gòu)象，這對SEA0400的變構(gòu)結(jié)合至關(guān)重要。鈣成像功能實(shí)驗也顯示，XIP對于NCX對SEA0400的敏感性至關(guān)重要。進(jìn)一步結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)在逆向轉(zhuǎn)運(yùn)模式下，高濃度的細(xì)胞內(nèi)Na⁺促進(jìn)了XIP與TMD和CBD2的相互作用，導(dǎo)致NCX1.3的失活，而這一過程還穩(wěn)定了SEA0400的變構(gòu)結(jié)合口袋。這些發(fā)現(xiàn)揭示了XIP和SEA0400協(xié)同抑制NCX1.3，以及SEA0400在逆向轉(zhuǎn)運(yùn)模式下選擇性地靶向NCX1.3的分子基礎(chǔ)。

中國科學(xué)院生物物理所研究所趙巖研究員為本文通訊作者，中國科學(xué)院生物物理研究所特別研究助理董艷麗、博士研究生于卓亞和博士研究生李悅為論文共同**作者，此外，北京望石智慧黃博，趙巖組白秦儒、高逸偉、陳琦浩、何玲莉，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院李娜也為本研究提供了幫助。清華大學(xué)的肖百龍課題組提供了鈣成像實(shí)驗的指導(dǎo)。冷凍電鏡數(shù)據(jù)和鈣成像實(shí)驗數(shù)據(jù)收集得到中國科學(xué)院生物物理研究所蛋白質(zhì)科學(xué)研究平臺生物成像中心的技術(shù)支持。本研究得到科技創(chuàng)新2030"腦科學(xué)與類腦研究"重大項目、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項（B類）、國家自然科學(xué)基金項目、國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目、中國博士后科學(xué)基金、中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會等項目的資助。

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