DNA引物酶促進轉錄復制間的競爭并影響基因組穩定性的新機制

轉錄和復制是生物體維持和傳遞遺傳信息的重要事件，它們以同一套基因組為模板，因而常會發生轉錄-復制對撞，誘發R-loop積累和DNA斷裂，導致基因組損傷。R-loop是由雜合雙鏈RNA:DNA和單鏈DNA組成的三鏈核酸結構，其過量積累會導致基因組不穩定，因此生物體進化出了一系列機制調控基因組內R-loop的水平。其中核糖核酸酶RNase H能夠特異消化RNA:DNA雜合鏈中的RNA，從而清除R-loop，維持基因組穩定。

2024年1月2日，生命中心孫前文實驗室在《自然·通訊》(Nature Communications)雜志上發表了題為“引物酶促進轉錄和復制在同一模板鏈上的競爭從而導致DNA損傷” (Primase promotes the competition between transcription and replication on the same template strand resulting in DNA damage)的研究論文。該研究揭示了擬南芥葉綠體DNA復制引物酶促進葉綠體基因組的轉錄復制競爭和R-loop積累，從而誘發葉綠體基因組斷裂的分子機制。

葉綠體是植物進行光合作用的場所，孫前文實驗室前期鑒定了擬南芥基因組編碼的三個RNase H1蛋白，并發現定位于葉綠體的AtRNH1C蛋白可以與DNA Gyrase（拓撲異構酶）互作解除葉綠體基因組的轉錄復制對撞，清除R-loop，減少DNA的損傷。atrnh1c突變體的葉綠體基因組內R-loop過量積累，高轉錄復制對撞區域DNA斷裂增多，從而引發葉片黃化，植物矮小的表型（Yang et al., The Plant Cell 2017）。

為進一步探究參與基因組穩定性和R-loop調控的新因子，孫前文實驗室對atrnh1c突變體進行EMS誘變篩選，獲得多個表型抑制突變體。其中acs1（atrnh1c suppressor 1）突變體無論是葉片顏色，光合效率，以及葉綠體的數目和形態，與atrnh1c相比均有顯著恢復（圖1a和b）。通過基因定位和功能驗證鑒定到ACS1基因編碼一個葉綠體和線粒體雙向定位的引物酶ATH（圖1c-f）。引物酶在DNA復制過程中合成小的RNA片段，引導合成新的DNA鏈。

在acs1突變體中，ATH蛋白的一個跨物種間高度保守的氨基酸發生替換，導致蛋白與DNA模板的結合能力變弱，合成RNA引物以及介導DNA復制酶合成DNA的能力下降，從而減緩了轉錄-復制對撞和R-loop積累，使得atrnh1c突變體的表型缺陷發生一定程度的恢復（圖2a-c）。通過鏈特異性的DNA斷裂測序發現，在葉綠體基因組中高轉錄復制對撞的rDNA區域，轉錄和后隨鏈的復制在同一條DNA鏈上進行，這條鏈的轉錄本末端存在特異且較高程度的單鏈DNA斷裂（圖2d和e）。通過構建葉綠體DNA復制酶Pol1A與AtRNH1C的雙突材料1cpol1a，進一步驗證了減緩復制可以減輕轉錄-復制對撞和R-loop積累，從而維持基因組穩定，恢復atrnh1c突變表型。 此外，作者發現超表達引物酶ATH會促進葉綠體基因組中R-loop過量積累，誘發DNA斷裂，并引起植株產生新葉黃化的表型（圖3 a和b）；而通過基因編輯敲除ATH則會導致胚胎致死，胚胎發育停滯在球形胚期（圖3 c-f）。這些結果表明細胞器中的引物酶ATH對于擬南芥的正常生長發育不可或缺。

綜上，本研究通過篩選擬南芥葉綠體中高度積累R-loop的atrnh1c突變體的回復突變，揭示了引物酶在調控基因組轉錄復制對撞中的作用，對于研究其他物種中的R-loop和基因組穩定性的調控機制具有借鑒意義。同時，本研究也證實了擬南芥細胞器引物酶ATH的適當表達水平對于植物的生長發育的重要性。

清華大學生命科學學院博士后張衛峰為該論文**作者，孫前文副教授為本文通訊作者，孫前文實驗室已畢業博士生楊卓和已出站博士后王文杰也參與了該項研究。該工作得到國家自然科學基金、生命科學聯合中心、中國博士后科學基金等經費的支持。

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