病毒microRNA簇中的順式調控

　　MicroRNAs(MiRNAs)是一種小的調控RNA，幾乎參與了所有的生物過程。雖然它們中的許多是從簇中共表達的，但關于這個組織對它們積累調控的影響知之甚少。在這項研究中，作者試圖破譯一種控制卡波西肉瘤相關皰疹病毒(Kshv)10個聚集的前miRNAs表達的調控機制。作者在體外測定了微處理器對單個Pre-miRNA的切割效率，發現Pre-miR-K1和-K3是切割效率最高的Pre-miRNAs。突變分析表明，除了產生成熟的miRNAs外，它們對整個miRNAs的優化表達也很重要。作者證明了這一特征依賴于該位置是否存在規范的PremiRNA，因為可以在功能上用異源的PremiRNA取代PremiR-K1。進一步的體外加工分析表明，兩個莖環在順式作用，簇是以順序的方式切割的。最后，作者利用該簇的這一特性，通過在表達合成結構或潛伏感染KSHV的細胞中用基于LNA的反義寡核苷酸靶向Premir-K1來抑制整個miRNAs的表達。

　　卡波西肉瘤皰疹病毒(KSHV)或人類皰疹病毒8型是一種伽瑪皰疹病毒，與卡波西肉瘤、B淋巴瘤或增殖性疾病Castelman病等癌癥有關。它的基因組是一個165kb的～dsdna分子，編碼>90個開放閱讀框架(Orf)和25個成熟的microRNA(MiRNA)。KSHV通過限制病毒基因的表達建立終生持續感染。然而，有一小部分細胞(<3%)支持裂解復制，在某些條件下，KSHV可以從潛伏期重新激活到裂解復制。KSHV復制潛伏期和裂解期之間的動態平衡對于建立成功的病毒感染、維持潛伏期至關重要，并與腫瘤形成等致病效應有關。

　　有趣的是，所有KSHV前體(前)miRNAs都在同一個多順反子轉錄本上表達，這與潛伏期有關。其中10個基因(前miR-k1到-k9和miR-k11)聚集在～4kb的內含子中，位于orf71(v-flip)和kaposin基因之間，并在潛在啟動子的控制下表達。Premir-K10和Pre-miR-K12分別定位于kaposin基因的開放閱讀框(ORF)和3’非編碼區(3’UTR)，并受潛伏啟動子和裂解啟動子的控制。

　　KSHV miRNAs能夠調節病毒和細胞基因的表達，這些基因對病毒感染和相關疾病至關重要。在潛伏期大量表達，它們直接參與病毒的維持，例如直接或間接地通過靶向NF-kB途徑，復制和轉錄激活因子(Rta)，這是病毒重新激活的關鍵。它們還通過調節細胞凋亡、血管生成或細胞周期來促進腫瘤的發生。最后，KSHV miRNAs還通過調節宿主免疫反應來增強免疫逃避和病毒致病作用。

　　盡管目前對KSHV miRNAs功能的研究十分活躍，但對這些關鍵病毒因子的表達調控還沒有一個準確的認識。在動物體內，miRNA的生物發生是一個多步驟的過程，包括RNaseIII酶的兩個成熟過程。Mirna基因通常由rna聚合酶ii轉錄成幾千個堿基的長初級轉錄本(pri-mirna)，它可以含有一個或幾個mirna前體發夾(pre-mirna)。首先，pri-miRNA由微處理器在細胞核中處理，包括RNaseIII型酶DROSHA及其輔因子Dgcr8。在輸出到細胞質后，前miRNA被另一種與TRBP相關的RNaseIII酶Disher進一步加工。最終的結果是miRNAs的雙鏈(5p和3p)，其中一條鏈優先結合到Argonaute蛋白中，形成RISC復合體，然后RISC復合體可以被定向到靶mRNAs。存在miRNA生物發生的替代途徑，例如不依賴于DROSHA的Mirtron的處理或依賴于DICER的Ago2依賴的miR-451裂解。

　　微處理器對KSHV聚簇前mirna體外成熟的動力學分析

　　最后，作者開發了一種基于鎖定核酸(LNA)寡核苷酸的反義策略，在轉錄后下調整個KSHV miRNA簇的表達。使用針對前miR-K1序列5p或3p的LNA，作者成功地顯著降低了轉染合成構建物的細胞中聚集的KSHV miRNAs水平。作者還表明，在KSHV感染的細胞中，當LNA靶向Pre-miR-K1時，來自簇的新合成miRNAs的水平顯著下降，這表明這可能是一種有用的策略來阻斷感染細胞中的整個簇。