細(xì)胞培養(yǎng)中血清的是否需要熱滅活？

血清是否需要滅活？注意事項(xiàng)有哪些？

血清熱滅活非必要

血清熱滅活的步驟在1970年代就已建立，至今成為很多實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)血清前處理步驟；但許多先前認(rèn)為必須熱滅活的原因，卻早已經(jīng)不再成立。

血清熱滅活的爭(zhēng)議

至少70%的研究者對(duì)血清的滅活僅僅是因?yàn)樽裾粘Ｒ?guī)操作，或者說認(rèn)為是理所當(dāng)然的。常規(guī)滅活建議的溫度在45℃到62℃之間，而時(shí)間則從15分鐘到60分鐘不等，其中最常用的手法是56℃熱處理30分鐘。隨著血清采集、處理、加工工藝的提高，許多早先認(rèn)為是熱滅活的原因已經(jīng)不再成立，只有少數(shù)對(duì)血清進(jìn)行熱滅活的研究者在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了這一步驟的有效性和必要性。

熱敏補(bǔ)體與熱滅活

熱滅活目的是為了去除血清中補(bǔ)體等對(duì)熱敏感的物質(zhì)，但是在胎牛血清中對(duì)補(bǔ)體的滅活則明顯沒有必要。專業(yè)人士曾對(duì)商業(yè)胎牛血清中的補(bǔ)體成分進(jìn)行測(cè)定，他們發(fā)現(xiàn)胎牛血清中含有的C1，C6僅達(dá)成年動(dòng)物血清的1-3%，而其它補(bǔ)體成分僅有成年動(dòng)物的5-50%，至于補(bǔ)體的主要成分C3在胎牛血清中則幾乎不能檢出。通過補(bǔ)體固定實(shí)驗(yàn)，我們也在多個(gè)不同批次的胎牛血清中獲得了相似的結(jié)果。即使是在未稀釋的血清中，也未發(fā)現(xiàn)有明顯的溶血現(xiàn)象。另外，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室在培養(yǎng)前將培養(yǎng)液進(jìn)行預(yù)熱的過程，也對(duì)熱敏的補(bǔ)體有滅活的作用。

支原體與熱滅活

在對(duì)補(bǔ)體滅活以外，熱處理同時(shí)也對(duì)血清中可能存在的支原體具有滅活作用。多年以前，450納米孔徑的濾膜被用于加工血清時(shí)，血清中支原體的污染時(shí)有發(fā)生。針對(duì)這個(gè)問題，SPERIKON品牌胎牛血清經(jīng)過最嚴(yán)格的質(zhì)量控制篩選和驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)質(zhì)量體系符合cGMP要求，并通過ISO13485: 2016質(zhì)量認(rèn)證，確保了產(chǎn)品質(zhì)量，減少了批間差，無細(xì)菌、真菌、支原體及病毒污染，我們的血清產(chǎn)品中沒有再發(fā)現(xiàn)有支原體的污染，也是使得熱滅活成為不必要的另外一個(gè)原因。

胚胎發(fā)育與熱滅活

血清去除滅活步驟不影響牛胚胎的發(fā)育分化；有研究結(jié)果證實(shí)熱滅活步驟減弱了胎牛血清和小牛血清對(duì)細(xì)胞的促粘附作用，在用SV-BHK、BALB-3T3、CV－1、FS-4細(xì)胞對(duì)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)中，熱滅活對(duì)胎牛血清的影響小于對(duì)小牛血清的影響。

細(xì)胞株生長(zhǎng)與熱滅活

經(jīng)實(shí)驗(yàn)調(diào)查熱滅活對(duì)胎牛血清以及對(duì)其中不同細(xì)胞株生長(zhǎng)能力的影響。通過比較11個(gè)不同細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)其中熱滅活對(duì)6個(gè)細(xì)胞株（HBAE，MDBK，Vero，成纖維細(xì)胞，MRC-5）的生長(zhǎng)帶來負(fù)面影響，三個(gè)細(xì)胞株（FOX-NY，MDCK和CHO-K1）不受熱滅活的影響，而只有兩個(gè)細(xì)胞株（Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid），在熱滅活之后，細(xì)胞生長(zhǎng)有輕微的改善。所以，在正常的操作下，熱滅活通常對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有明顯的促進(jìn)作用。

沉淀與熱滅活

在正常操作下，熱滅活經(jīng)常給血清產(chǎn)品帶來負(fù)面的影響，對(duì)血清的加熱經(jīng)常導(dǎo)致血清中沉淀的產(chǎn)生，而導(dǎo)致的沉淀又常常被認(rèn)為是微生物的污染。注意到這個(gè)現(xiàn)象之后，為了驗(yàn)證污染的存在，或者促進(jìn)沉淀的溶解，許多培養(yǎng)者往往將血清放置37℃溫育。這卻往往使情況變得更糟，血清中的蛋白進(jìn)一步的析出，為了確信血清未被污染，進(jìn)行的鏡檢，無菌培養(yǎng)試驗(yàn)，和革蘭氏染色試驗(yàn)更是浪費(fèi)了實(shí)驗(yàn)者大量的時(shí)間和精力。

結(jié)論

總之，多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)中血清的熱滅活并不是必要的。很多場(chǎng)合下，熱滅活并不會(huì)改善細(xì)胞的生長(zhǎng)，卻降低了支持細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。即使在少數(shù)有促進(jìn)的情況下，其促進(jìn)的比率也是微不足道的。另外，血清的熱滅活導(dǎo)致的沉淀常常被認(rèn)為是微生物的污染，從而給用戶和供應(yīng)商都帶來不必要的麻煩。我們建議，對(duì)于那些對(duì)血清進(jìn)行滅活的用戶，需要通過試驗(yàn)來證實(shí)其必要性，確定滅活的適當(dāng)條件；在滅活過程中，需要嚴(yán)格認(rèn)真監(jiān)測(cè)，并選擇一個(gè)可重復(fù)的方案進(jìn)行操作。

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