支原體檢測(cè)pcr法有驗(yàn)證方案嗎

確認(rèn)所采用的支原體 PCR 檢測(cè)方法在檢測(cè)限、特異性、準(zhǔn)確性、精密度和耐用性等方面符合預(yù)期要求，能夠準(zhǔn)確、可靠地檢測(cè)樣本中的支原體。

驗(yàn)證范圍

適用于使用 PCR 法對(duì)各類(lèi)樣本（如細(xì)胞培養(yǎng)物、生物制品、臨床樣本等）中的支原體進(jìn)行檢測(cè)。

驗(yàn)證內(nèi)容及方法

檢測(cè)限驗(yàn)證

標(biāo)準(zhǔn)品制備：獲取或制備已知濃度的支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株，如豬鼻支原體、口腔支原體、肺炎支原體等，將其進(jìn)行系列稀釋?zhuān)玫讲煌瑵舛鹊臉?biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度范圍應(yīng)涵蓋預(yù)期的檢測(cè)限及以下搜狐網(wǎng)。

PCR 檢測(cè)：使用待驗(yàn)證的 PCR 方法對(duì)各濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度至少進(jìn)行 3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果判斷：以能夠穩(wěn)定檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果的最低標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為該方法的檢測(cè)限。歐洲藥典規(guī)定，支原體核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法如替代培養(yǎng)法，對(duì)常見(jiàn) 9 種支原體的檢測(cè)限需均達(dá)到 10CFU/ml。

特異性驗(yàn)證

選擇對(duì)照菌株：除了支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株外，還應(yīng)選擇與支原體具有較近親緣關(guān)系的細(xì)菌，如梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌等，以及可能存在于樣本中的其他微生物作為對(duì)照。

PCR 檢測(cè)：分別以支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株、對(duì)照菌株和陰性對(duì)照（無(wú)模板）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

結(jié)果判斷：只有支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶或熒光信號(hào)，而對(duì)照菌株和陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增，表明該方法具有良好的特異性。

準(zhǔn)確性驗(yàn)證

樣本選擇：選取已知感染支原體的陽(yáng)性樣本和未感染支原體的陰性樣本，陽(yáng)性樣本可以是經(jīng)其他可靠方法確認(rèn)的臨床樣本、細(xì)胞培養(yǎng)物等，陰性樣本應(yīng)確保無(wú)支原體污染。

PCR 檢測(cè)：使用待驗(yàn)證的 PCR 方法對(duì)陽(yáng)性和陰性樣本進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果判斷：與已知結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，陽(yáng)性樣本檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性，陰性樣本檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性，計(jì)算準(zhǔn)確率。準(zhǔn)確率 =（真陽(yáng)性 + 真陰性）/（總樣本數(shù)）×100%，準(zhǔn)確率應(yīng)達(dá)到較高水平，一般要求在 95% 以上。

精密度驗(yàn)證

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：選取高、中、低不同濃度的支原體標(biāo)準(zhǔn)品或陽(yáng)性樣本，在同一實(shí)驗(yàn)條件下，由同一操作人員使用同一臺(tái) PCR 儀，在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)，一般重復(fù)次數(shù)不少于 10 次。

中間精密度實(shí)驗(yàn)：不同操作人員在不同時(shí)間、使用不同的 PCR 儀和試劑批次對(duì)上述樣本進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果判斷：計(jì)算重復(fù)性和中間精密度實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，變異系數(shù)應(yīng)在可接受范圍內(nèi)，一般要求小于 15%。

耐用性驗(yàn)證

改變反應(yīng)條件：分別對(duì) PCR 反應(yīng)的退火溫度、引物濃度、模板量、循環(huán)次數(shù)等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)母淖儯缭跇?biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，將退火溫度上下浮動(dòng) 5℃，引物濃度增加或減少 1 倍等。

PCR 檢測(cè)：使用改變條件后的反應(yīng)體系對(duì)支原體標(biāo)準(zhǔn)品和陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果判斷：觀察檢測(cè)結(jié)果的變化情況，若在一定范圍內(nèi)改變反應(yīng)條件后，仍能準(zhǔn)確檢測(cè)出支原體，且檢測(cè)限、特異性、準(zhǔn)確性等指標(biāo)無(wú)明顯變化，則表明該方法具有較好的耐用性。

驗(yàn)證結(jié)果記錄與報(bào)告

詳細(xì)記錄每次實(shí)驗(yàn)的條件、樣本信息、檢測(cè)結(jié)果等數(shù)據(jù)。

對(duì)驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和總結(jié)，撰寫(xiě)驗(yàn)證報(bào)告，包括驗(yàn)證目的、方法、結(jié)果、結(jié)論以及建議等內(nèi)容。如果驗(yàn)證結(jié)果符合要求，則該 PCR 方法可用于常規(guī)支原體檢測(cè)；如果不符合要求，則需要對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，重新進(jìn)行驗(yàn)證。