研究發現CRISPR-Cas系統具備反式切割pre-crRNA活性并開發簡化版核酸檢測工具

2024年12月16日，生命科學學院劉亮教授團隊在《Nucleic Acids Research》期刊上在線發表了題為“DNA target binding-induced pre-crRNA processing in type II and V CRISPR-Cas systems”的研究論文，**揭示了靶標核酸的結合能夠激活CRISPR-Cas系統效應蛋白對pre-crRNA的反式切割活性，并基于該特性開發了一種新型核酸檢測方法。尤為重要的是，該研究**證實了CRISPR-Cas12a系統在體內結合靶標DNA后能夠反式切割pre-crRNA間隔區，這對基于Cas12a的基因編輯工具的開發具有深遠影響。

CRISPR-Cas系統是源自細菌和古細菌的適應性免疫系統，用以抵御病毒和其他外來遺傳物質的入侵。該系統的運作分為三個主要階段：間隔區序列的獲取、CRISPR RNA（crRNA）的加工成熟以及對外源核酸的干擾。其中，crRNA的成熟是CRISPR效應復合體發揮功能的必要條件，涉及到對前體crRNA（pre-crRNA）的重復區（Repeat）和間隔區（Spacer）序列的加工。此前的研究表明，在II型CRISPR-Cas系統中，crRNA的repeat區序列與另一小RNA分子tracrRNA配對后，由RNase III酶進行切割；而在V型系統中，CRISPR-Cas效應蛋白能夠直接加工pre-crRNA的repeat區。然而，對于spacer區是如何被加工仍未得到闡明。

在該研究中，團隊成員首先發現，在體外條件下，未加工成熟的spacer區顯著降低了V型CRISPR-Cas12a系統的順式和反式切割活性，這表明pre-crRNA中spacer區的加工成熟對Cas12a的活性至關重要。既往研究表明，Cas12a通過其WED結構域對pre-crRNA的repeat區進行加工，但在體外實驗中，Cas12a對spacer區并沒有表現出明顯的切割作用。鑒于靶標DNA（target DNA）可以激活Cas12a對非靶標ssDNA的反式切割，研究人員進一步探討了這種反式切割活性是否參與了spacer區的加工成熟。實驗結果顯示，target DNA確實可以在體外激活Cas12a的RuvC結構域來加工pre-crRNA的spacer區域。此外，團隊成員也在其他V型CRISPR-Cas系統成員，如Cas12b、Cas12i和Cas12j，以及II型CRISPR-Cas9中觀察到了這一現象。與Cas12a稍不同，Cas9僅在單鏈靶標DNA存在的情況下才會啟動對pre-crRNA的spacer區的反式切割，且Cas9的HNH和RuvC結構域對于pre-crRNA的反式切割都是必需的。為了驗證這一加工過程在體內是否同樣發生，研究人員使用大腸桿菌異源表達系統來模擬體內條件，用于觀察CRISPR-Cas12a在體內結合target DNA后對pre-crRNA的反式切割情況。通過Northern blot和small RNA測序實驗，研究人員證實了CRISPR-Cas12a系統在體內存在target DNA且RuvC催化結構域完整的情況下，其pre-crRNA間隔區會被進一步加工。為了深入了解target DNA如何激活II型和V型CRISPR-Cas效應蛋白反式切割pre-crRNA過程，研究人員解析了一系列Cas12a和Cas9與target DNA及crRNA的復合物晶體結構。通過比較分析，提出了基于crRNA種子序列的初始靶標核酸識別機制，以及構象重排依賴的RuvC核酸酶結構域激活機制。

基于上述發現，團隊開發了一種基于Cas12a的新型核酸檢測平臺—PDCD（Pre-crRNA-dependent Cleavage Detection）。這一檢測方法通過將熒光基團及淬滅基團直接結合在pre-crRNA間隔區切割位點的兩側，利用Cas12a結合靶標核酸后激活的pre-crRNA反式切割活性，使得熒光基團遠離淬滅基團從而釋放出可檢測熒光信號，實現對DNA的靈敏檢測。利用該平臺，團隊成功實現了對猴痘病毒和SARS-CoV-2病毒的高特異性、高靈敏度的簡單快速檢測，展示了該技術在分子診斷領域的應用潛力。

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