‘帶貨’能力更強的遞送載體eVLP定向進化——讓基因編輯/蛋白質遞送更安全有效

最近發表在《Nature Biotechnology》雜志上的一項報告探究了一種新的、能夠“定向進化”出具有增強轉導能力和生產能力的工程病毒樣顆粒（eVLP）的系統。突破性定向進化系統促進病毒樣顆粒進行更安全、更有效的基因編輯，為下一代治療創新提供了強大的工具。

在體外和體內有效和安全地將大分子輸送到特定細胞中的能力，對于各種新興的治療方式至關重要。目前主流的遞送載體包括腺相關病毒載體（AAV）、慢病毒載體及非病毒載體如脂質納米顆粒（LNP）等，但它們各自存在一些局限性。因此，仍需要開發新的遞送方法來克服這些限制，實現更精準高效更大載量的遞送。

病毒樣顆粒（VLPs，virus-like particles）是一種由病毒衣殼蛋白自發組裝而成的納米顆粒，兼具病毒粒子組織趨向性和高效轉導能力又不含病毒遺傳物質——可避免病毒載體潛在的安全風險，且具有非病毒載體的瞬時遞送特性——“業務范圍”包括遞送mRNA、蛋白質或核糖核蛋白（RNP）等生物大分子“貨物”，能減少脫靶編輯和實現瞬時“貨物”表達。以該研究作者此前開發的eVLP——工程化病毒樣顆粒為例，貨物蛋白與eVLP中的逆轉錄病毒Gag蛋白融合，在病毒顆粒包裝形成時將貨物定位到病毒顆粒中。貨物-Gag之間的連接序列中包含一個序列，可由逆轉錄酶裂解，隨后將病毒樣顆粒內的貨物釋放到轉導的細胞中，在體外和體內實現更有效的傳遞。

要尋找能更有效包裝“貨物”、或者更高轉導效率的病毒類遞送載體，通常的做法是利用病毒基因組突變文庫定向篩選的實驗室定向進化。但是，所有定向進化系統都需要一種方法，在進行特定屬性的選擇之后能確定所需的突變體。由于eVLPS沒有包裝任何病毒性遺傳物質，應用定向進化來改善eVLPS需要開發一種替代策略來編碼標記eVLP突變的身份。這篇報告中，研究人員設想在eVLP包裝的貨物中插入一段帶條碼（barcoded）的sgRNA，在無DNA的 eVLP包裝貨物中作為每個eVLP突變體的**標識，這樣經過所需屬性的篩選后，排名靠前的幸存者就可以通過**標識而被識別出來。這種針對eVLP的定向實驗室進化條碼策略原則上可用于不同的eVLP組分，比如衣殼、包膜和其他結構蛋白，只要把條碼sgRNA和進化目標放在一起，能夠發現具有改進特性的eVLP突變體。

作者首先驗證帶條碼的sgRNA與功能性eVLP生產兼容。他們將15個堿基的條碼序列插入sgRNA骨架的四核苷酸環（ tetraloop）——此位置和插入長度不會影響sgRNA功能。他們用此前開發的第四代（v4）堿基編輯器(BE)- eVLP——包裝了一個活性腺嘌呤BE (ABE) RNP貨物，進行驗證實驗。通過將4個質粒——分別編碼Gag-ABE融合、Moloney小鼠白血病病毒（MMLV）Gag-Pro-Pol多蛋白（其中含有所需的病毒蛋白酶和其他結構性成分）、水皰性口炎病毒G（(VsV-G)）包膜蛋白、和指導靶標堿基編輯的sgRNA——共轉染到產生細胞中制備標準v4 BE-eVLPs。

作者制備了含有標準和四種分別帶不同條碼sgRNA的v4 eVLP，并通過測量它們轉導HEK293T細胞后的堿基編輯效率（BCL11A位點）進行了比較。他們發現具有不同條碼sgRNA的eVLP具有相當的效力，均與標準eVLP相當。這說明他們“加塞”條碼的sgRNA能夠與功能性eVLP生產兼容，基本不影響。此外，缺乏Gag-ABE融合的eVLP比標準v4 eVLP封裝的sgRNA少216倍。

然后作者驗證了帶條碼的eVLPS可以用來區分具有不同功能性質的EVLP突變體。為此進行了兩個模擬篩選：一個是包裝貨物的eVLP生產選擇，另一個是HK293T細胞的EVLP轉導選擇。結果表明，帶條碼的sgRNA可以用于標記不同的eVLP突變體，并且經過選擇后富集的條碼可以識別出適應性增強的突變體，驗證了條碼化eVLP進化系統的關鍵，并確立了一個用于使用條碼sgRNA來識別具有所需屬性的eVLP突變體的框架。

V5

接下來，作者應用條碼化eVLP進化系統來選擇具有改進性能的eVLP衣殼。V4 eVLPS中使用的衣殼蛋白與野生型MMLV中使用的衣殼蛋白相同——這個在自然界中已經進化成為包裝病毒基因組的**選擇。而對于包裝大型的非本土蛋白貨物，這可能不是**的。作者假設改造eVLP衣殼蛋白內部或許能夠優化ABE RNP貨物包裝，而不是病毒基因組包裝，可以提高eVLP的性能，包括每個顆粒的效力、每個顆粒包裝的貨物分子數、總體顆粒產量或滴度和顆粒穩定性。

為此，作者生成了一個帶條碼的eVLP衣殼文庫——包含了Gag-ABE貨物中MMLV Gag蛋白衣殼和核衣殼結構域的3762個單殘基突變體，并實施了一個庫建設策略以保存條碼和突變體之間的聯系，以便對選擇結果進行解碼。用這個條碼庫構建條碼eVLP生產細胞庫，生產eVLP，并純化得到的衣殼突變體文庫。

條碼化eVLP衣殼文庫分別進行兩次篩選，以提高生產細胞的產量和對HEK293T細胞的轉導。

隨后，分離出eVLP包裝的sgRNA，并對經過產量篩選出的條碼進行測序。對每個條碼序列的eVLP產物的富集程度進行了評估，與標準eVLP衣殼相比，鑒定出eVLP富集程度更高的條碼。文庫中約8%的衣殼突變體比標準eVLP衣殼具有更高的產量富集。由于大多數衣殼突變很可能會破壞小心的組織過程，因此篩選出比標準衣殼更高效的突變是少見的。

HEK293T細胞用純化的條碼化eVLP衣殼文庫孵育。6小時后，分離轉導到靶細胞的sgRNA，計算每個條碼序列的eVLP轉導富集。

只有0.7%的衣殼突變體的平均轉導富集度高于標準v4 eVLP衣殼。衣殼突變體更有可能提高eVLP生產或RNP貨物包裝，但很少提高類病毒顆粒穩定性、進入細胞或其他影響轉導的特性。

根據生產效率或轉導選擇富集，選擇了幾個突變體進行進一步分析。優先考慮那些能提高一種特性而不損害另一種特性的突變體。

在Gag-ABE構建體中引入衣殼突變并沒有增加效力。研究人員評估了具有Q226P突變的Gag-ABE構建體的衣殼突變的效力，該突變在Gag-Pro-Pol構建體的生產選擇中最為豐富（GagQ226P-Pro-Pol）。與V4 eVLP相比，不同的衣殼突變體將BE的遞送能力提高了三倍。C507V、C507F、A505W、D502Q、R501I 5個突變的效價最高；然而，一個突變組合GagC507V-ABE與GagQ226P-Pro-Pol的效力提高了3.7倍，被指定為第五代（v5）BE - eVLP。

比較了V4和V5 BE- eVLP的效價，結果表明V5的堿基編輯效率顯著高于V4。

本研究的研究人員開發了具有所需特性的eVLP定向進化系統，并利用該系統突變/選擇具有增強特性的eVLP衣殼突變體。此外，與v4版 eVLP相比，v5 eVLP具有增強的貨物包裝和釋放，更大的粒徑和更高的遞送效力。總的來說，這種帶條形碼的eVLP進化方法可以支持未來運載工具的開發，克服當前基因編輯系統的局限性。

本網站所有轉載文章系出于傳遞更多信息之目的，轉載內容不代表本站立場。不希望被轉載的媒體或個人可與我們聯系，我們將立即進行刪除處理。