研究，ANKFY1-ATG2介導(dǎo)內(nèi)體到自噬小體脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)男聶C(jī)制

巨自噬（以下稱“自噬”）是細(xì)胞內(nèi)重要降解途徑，用以維持細(xì)胞生存和正常生理功能，其中自噬體是執(zhí)行該過程的關(guān)鍵細(xì)胞器。在自噬體的生成過程中，細(xì)胞內(nèi)首先會(huì)形成一個(gè)扁平膜結(jié)構(gòu)，被稱為“phagophore”，接著該膜結(jié)構(gòu)會(huì)逐漸延展，包裹待降解的底物后封閉形成自噬體。最后自噬體與溶酶體發(fā)生融合，自噬體內(nèi)的底物被降解，供細(xì)胞回收利用。

據(jù)估計(jì)，細(xì)胞自噬過程中需要?jiǎng)訂T數(shù)百萬(wàn)個(gè)脂質(zhì)分子用于自噬體的延伸。到目前為止，關(guān)于自噬體膜延伸的脂質(zhì)傳遞機(jī)制，有三種較為廣泛接受的理論：囊泡介導(dǎo)的脂質(zhì)傳遞、來自已存在的細(xì)胞器的膜外推，以及蛋白介導(dǎo)的脂質(zhì)運(yùn)輸。在蛋白介導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)模型中，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)延伸中的自噬體膜結(jié)構(gòu)和其他細(xì)胞器之間脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。ATG2作為細(xì)胞自噬過程中被研究最多的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，被認(rèn)為在自噬體形成的早期階段促進(jìn)了來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和正在生長(zhǎng)的自噬體間的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。其中，ATG2通過自噬體上的PI3P效應(yīng)蛋白WIPI4的相互作用而被穩(wěn)定的固定在自噬體膜結(jié)構(gòu)上，這種穩(wěn)定的結(jié)合有助于促進(jìn)ATG2行使其脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能。細(xì)胞內(nèi)許多不同的細(xì)胞器被認(rèn)為是支持自噬體生長(zhǎng)的膜來源，但目前還不清楚 ATG2 是否可以將脂質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的其他細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)到自噬體膜結(jié)構(gòu)。

4月16日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系鐘清、留筱廈課題組在Cell Discovery在線發(fā)表題為ANKFY1 bridges ATG2A-mediated lipid transfer from endosomes to phagophores的研究論文，發(fā)現(xiàn)ANKFY1可以將ATG2A錨定在內(nèi)體上，協(xié)助ATG2A轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)體上的脂質(zhì)到自噬小體上，從而促進(jìn)自噬體的膜延伸，闡明了ATG2A作為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的關(guān)鍵蛋白介導(dǎo)內(nèi)體與自噬體間脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制，為內(nèi)體作為自噬體膜來源提供有力證據(jù)。

在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)通過基于ATG2A的級(jí)聯(lián)親和純化，鑒定到ATG2A相互作用蛋白ANKFY1（含有Ankyrin重復(fù)和FYVE結(jié)構(gòu)蛋白1），發(fā)現(xiàn)在自噬誘導(dǎo)下細(xì)胞內(nèi)一部分ANKFY1與ATG2A共定位于在內(nèi)體和自噬小體之間。隨著ANKFY1的耗竭，細(xì)胞內(nèi)自噬體膜結(jié)構(gòu)延伸障礙，且自噬通量受阻，這與ATG2A/B的耗竭表型相似，猜測(cè)ANKFY1參與ATG2介導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程。為了證明這個(gè)猜測(cè)，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了Halo-LC3穩(wěn)定細(xì)胞系，通過熒光標(biāo)記的不可透膜（MIL）和可穿透膜（MPL）的Halo tag配體，分別對(duì)可進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的和被自噬體隔離的HT-LC3進(jìn)行順序標(biāo)記，在細(xì)胞內(nèi)特異性的檢測(cè)自噬小體、新生成的自噬體以及成熟自噬體結(jié)構(gòu)，以此指征細(xì)胞內(nèi)不同狀態(tài)的自噬體。基于該實(shí)驗(yàn)并結(jié)合透射電鏡結(jié)果，研究人員發(fā)現(xiàn)ANKFY1的耗竭會(huì)影響自噬體的生長(zhǎng)和閉合。

為了更進(jìn)一步探究ANKFY1在ATG2介導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的功能，研究團(tuán)隊(duì)嘗試生化重建脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)這一生物學(xué)過程，在體外建立了基于FRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體系-Lipid transfer assay。利用該體系并結(jié)合蛋白-脂質(zhì)體共漂浮實(shí)驗(yàn)和動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)ANKFY1可以通過其FYVE結(jié)構(gòu)域結(jié)合富含PI3P的脂質(zhì)體，幫助ATG2A錨定在膜表面，并促進(jìn)ATG2在包含PI3P的脂質(zhì)體間傳輸脂質(zhì)。

最后，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ANKFY1耗竭導(dǎo)致自噬體上PI3P含量下降，與ATG2耗竭或UVRAG（介導(dǎo)內(nèi)體PI3P生成）耗竭的表型一致。這些數(shù)據(jù)表明，在自噬激活時(shí)，ATG2與ANKFY1可能將PI3P脂質(zhì)從內(nèi)體轉(zhuǎn)移到自噬體膜結(jié)構(gòu)上。

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