microRNA表達(dá)的活細(xì)胞成像與轉(zhuǎn)錄后反饋控制

　　microrna (mirna)是真核細(xì)胞中調(diào)控復(fù)雜基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的小型非編碼rna。由于其獨(dú)特的表達(dá)模式，mirna是特定細(xì)胞狀態(tài)的潛在分子標(biāo)記物。雖然需要一個(gè)能夠在活細(xì)胞中成像miRNA的系統(tǒng)來(lái)直觀地檢測(cè)miRNA的表達(dá)，但很少有響應(yīng)靶miRNA表達(dá)的熒光信號(hào)傳感器(miron傳感器)可用。

　　在這里，作者報(bào)道了一個(gè)包含雙向啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Csy4核糖核酸內(nèi)切酶和綠色熒光蛋白ZsGreen1的miron傳感器，用于轉(zhuǎn)錄后反饋控制的miRNAs活細(xì)胞成像。Csy4 輔助的 miR-ON (Csy4-miR-ON) 傳感器產(chǎn)生的背景可以忽略不計(jì)，但對(duì)目標(biāo) miRNA 反應(yīng)靈敏，允許在各種人類細(xì)胞中對(duì) miRNA 進(jìn)行高對(duì)比度熒光檢測(cè)。作者發(fā)現(xiàn)，Csy4-miRON傳感器能夠在體外和體內(nèi)對(duì)各種mirna進(jìn)行成像，包括miR-21、miR-302a和miR-133。這個(gè)強(qiáng)大的工具可以用來(lái)評(píng)估m(xù)iRNA表達(dá)在不同的生物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

　　microrna (mirna)是一類調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼小rna。不同類型的細(xì)胞表現(xiàn)出獨(dú)特的miRNA表達(dá)模式，在分化、腫瘤發(fā)生和病毒感染等物理和病理過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化。miRNA表達(dá)異常與廣泛的人類疾病的發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān); 因此，mirna是潛在的治療和診斷靶點(diǎn)。針對(duì)參與腫瘤進(jìn)展或抑制的 miRNA 的策略已被廣泛探索用于癌癥治療。此外，一些mirna在特定的細(xì)胞類型中高度表達(dá)，在許多情況下，直接參與決定細(xì)胞命運(yùn)。因此，這些mirna可以作為明確的分子標(biāo)記，從異質(zhì)細(xì)胞群中分離出特定的細(xì)胞。

　　miRNA表達(dá)的研究可以揭示miRNA的功能，并用于評(píng)估細(xì)胞狀態(tài)。Northern blot、微陣列、定量逆轉(zhuǎn)錄酶PCR和最近的RNA測(cè)序已被廣泛用作分析mirna表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。然而，這些方法與細(xì)胞裂解相關(guān)，因此不適合檢測(cè)活細(xì)胞中miRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。此外，由此產(chǎn)生的大量miRNA群體不太可能適合單細(xì)胞分析。相比之下，基于熒光或生物發(fā)光成像的無(wú)創(chuàng)技術(shù)在實(shí)時(shí)分析miRNA表達(dá)方面非常有利。

　　此前，作者和其他人已經(jīng)報(bào)道了含有熒光報(bào)告基因的miRNA傳感器系統(tǒng)，該基因含有多個(gè)互補(bǔ)序列，針對(duì)其3 '非翻譯區(qū)(UTR)感興趣的miRNA。在這些系統(tǒng)中，靶miRNA與其互補(bǔ)序列的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致報(bào)告基因編碼mrna的降解，導(dǎo)致報(bào)告基因活性降低。這種類型的miRNA傳感器(miroff傳感器)通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度下降的程度，可以實(shí)時(shí)、長(zhǎng)期跟蹤活細(xì)胞中miRNA的表達(dá)。miroff傳感器已經(jīng)成功地用于分析培養(yǎng)細(xì)胞和動(dòng)物中的mirna。

　　盡管 miR-OFF 傳感器具有顯著的效力，但由于 miRNA 活性檢測(cè)的模式，很難區(qū)分由 miRNA 表達(dá)以外的原因引起的假陽(yáng)性； 即熒光消失。重要的是，驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的啟動(dòng)子活性取決于細(xì)胞類型、基因組背景和表觀遺傳控制; 在某些情況下，如長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)或細(xì)胞分化，啟動(dòng)子活性降低或喪失是可能的。為了降低誤報(bào)的風(fēng)險(xiǎn)，需要一種miRNA表達(dá)時(shí)產(chǎn)生熒光的miRNA傳感器(miron傳感器)。特別是，基因編碼的基于熒光的miron傳感器在培養(yǎng)細(xì)胞和動(dòng)物中miRNA表達(dá)的活細(xì)胞成像方面具有優(yōu)勢(shì)。此外，這些miron傳感器可能適用于長(zhǎng)期的miRNA檢測(cè)。

　　因此，miron傳感器應(yīng)該能夠?qū)δ[瘤發(fā)生等發(fā)病過(guò)程中的miRNA表達(dá)進(jìn)行可靠的評(píng)估，使其成為非侵襲性診斷的潛在工具。此外，這些傳感器可用于分離體外分化和細(xì)胞重編程后表達(dá)組織特異性mirna的細(xì)胞，為細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)制備細(xì)胞來(lái)源。然而，一些固有的困難，包括準(zhǔn)確的開關(guān)和適當(dāng)?shù)男旁氡仍鲆妫窃O(shè)計(jì)一個(gè)有效的miRON系統(tǒng)能夠敏感地檢測(cè)miRNA表達(dá)的挑戰(zhàn)。

　　在本研究中，作者報(bào)道了一個(gè)基于miRNA-responsive Csy4轉(zhuǎn)錄后反饋控制的miron系統(tǒng)。Csy4是一種核糖核酸內(nèi)切酶，負(fù)責(zé)處理來(lái)自銅綠假單胞菌中聚集的規(guī)律性間隔短回語(yǔ)重復(fù)序列(CRISPRs)的前體轉(zhuǎn)錄本。CRISPR系統(tǒng)通過(guò)使用與外源核酸互補(bǔ)的CRISPR相關(guān)(Cas)蛋白和CRISPR RNA復(fù)合物，在消除原核生物中的入侵寄生蟲方面發(fā)揮著核心作用。

　　Csy4 特異性識(shí)別保守莖環(huán)的 28 nt 序列，然后切割莖堿基的 3' 末端。Csy4已被廣泛應(yīng)用于rna -蛋白結(jié)合分析、可編程基因網(wǎng)絡(luò)設(shè)計(jì)、基因組編輯等生物學(xué)領(lǐng)域。作者設(shè)計(jì)了一個(gè)Csy4輔助miron (Csy4- miron)傳感器，包含Csy4基因和一個(gè)由雙向啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光報(bào)告蛋白ZsGreen1 (ZsG)。

　　csy4 - miron傳感器可用于在體內(nèi)和體外成像miRNA表達(dá)。重要的是，這種傳感器產(chǎn)生了固有的低背景，允許高對(duì)比度的熒光成像。作者提供了一個(gè)寶貴的工具miRNA分析和評(píng)估細(xì)胞狀態(tài)在不同的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究。