數字dPCR的基本原理和操作步驟

dPCR，數字聚合酶鏈反應（Digital PCR）是一種高度靈敏和準確的核酸檢測技術，它通過將目標分子在大量微小反應單元中進行數字化擴增和檢測，實現對稀有或低拷貝數目標的可靠定量。

dPCR的基本原理是將樣本中的目標分子均勻地分割成許多微小反應單元，并在每個反應單元中進行PCR擴增。通過對反應單元的陽性和陰性結果進行數字計數，可以確定目標分子的存在與否，從而實現精確定量。

dPCR的步驟

樣本準備：首先，從樣本中提取目標DNA或RNA，并根據需要進行適當的預處理，例如逆轉錄反應或DNA純化等。

樣本分割：將樣本分割成大量微小反應單元，可以使用微滴數字PCR芯片、微流控芯片或數字PCR芯片等分割技術。每個反應單元包含零個或一個目標分子。

PCR擴增：在每個微小反應單元中進行PCR擴增。由于每個反應單元中僅包含少量目標分子，使得擴增達到飽和狀態的概率較小，從而減少了PCR擴增效率對結果的影響。

結果測定：通常使用熒光探針、探針水解或熒光染料等方法對PCR產物進行檢測。根據產物是否達到熒光檢測閾值，可以判定每個反應單元是陽性還是陰性。

數據分析：將陽性和陰性結果的數字計數與總反應單元數量相比較，即可得到目標分子的絕對拷貝數，實現對目標分子的精確定量。