新研究開發多能干細胞(iPSC)衍生的腎類器官

研究人員已經產生了誘導多能干細胞(iPSC)衍生的腎類器官來模擬由COL4A5基因突變引起的Alport綜合征，并證明了化學伴侶蛋白的效用，以挽救由突變引起的蛋白質錯誤折疊和膠原蛋白錯誤組裝。這項研究發表在《Communications Biology》雜志上。

據估計，在美國和歐洲，阿爾波特綜合癥(AS)的發病率分別為5000分之一到5萬分之一，而在日本，估計約有1200人患有這種疾病。它是遺傳性腎小球腎炎的第二常見形式，由幾個基因(COL4A3、COL4A4或COL4A5)突變引起，這些基因在腎臟腎小球基底膜(GBM)中形成一種特殊類型的膠原(即α3α4α5[IV]膠原)，并在生命早期表現為終末期腎病(ESRD)。

不幸的是，由于缺乏體外模型來推斷和糾正AS患者膠原蛋白組裝缺陷，目前尚無根治性治療方法，其致病機制也未完全了解。

由Kenji Osafune教授(細胞生長與分化系)領導的中國CiRA和大正制藥有限公司的研究小組從兩名x連鎖AS患者身上制造了iPSCs，以生產腎臟類器官。具體來說，神戶大學的一組醫生收集了一名由COL4A5基因G545D錯義突變引起的輕度AS患者和另一名由T552Sfs*6移碼突變引起的嚴重AS患者的血液樣本，該突變產生了用于iPSC生成的截斷的膠原α5(IV)蛋白。

研究小組還利用CRISPR/Cas9基因組編輯系統制作了一個AS突變糾正的iPSC系，以逆轉輕度AS患者的COL4A5 G545D錯義突變。基于先前報道的經過一些修改的分化方案，他們通過患者特異性和健康對照iPSCs衍生的腎細胞祖細胞產生了腎類器官。

值得注意的是，研究人員觀察到，機械攪拌的腎類器官的自由漂浮培養有助于促進它們的成熟，這是本研究的一個關鍵特征，因為在腎臟發育過程中，GBM膠原組成從α1α1α2(IV)轉變為α3α4α5(IV)異源三聚體。

因此，研究人員能夠產生表達α5(IV)膠原的腎類器官，并在健康和突變糾正的輕度As iPSCs衍生的腎類器官的GBM樣結構中觀察到膠原α3α4α5(IV)。然而，反映臨床表型的是，輕度和重度AS iPSCs衍生的腎類器官表達α2(IV)而不表達α5(IV)膠原。

進一步的透射電子顯微鏡分析顯示，輕度和重度AS腎類器官均未顯示出先前在成年AS模型(Col4a5 G5x突變體)小鼠中觀察到的一些特征性GBM超微結構異常，這表明這種超微結構變化可能需要進一步成熟才能完全表現出來。

盡管如此，由于腎類器官已經達到了一個發育階段，可以重現IV型膠原的異構體轉換，研究人員可以區分來自輕度和重度AS病例的患者特異性iPSCs產生的腎類器官之間的差異。具體來說，COL4A5表達僅在嚴重AS腎類器官中降低，類似于COL4A5突變小鼠中觀察到的下調，可能是由疾病相關轉錄物的無義介導的衰變(NMD)造成的。

然而，引起輕度AS的G545D突變不太可能引發NMD，因此，COL4A5的表達在由輕度AS iPSCs產生的腎類器官中不受影響。此外，α3(IV)膠原蛋白在輕度AS腎臟類器官中檢測到，而在嚴重AS腎臟類器官中，盡管在RNA水平上表達正常，但未見α3(IV)膠原蛋白。以往的臨床研究表明，在表現為輕度癥狀的AS患者中可檢測到α3(IV)或α5(IV)蛋白，這說明腎類器官可以準確地模擬輕、重度AS病理的各個方面。

膠原異三聚體通常聚集在內質網(ER)，并由高爾基體分泌到細胞外空間。由蛋白質錯誤折疊引起的組裝缺陷會引起內質網應激，并引發未組裝或錯誤組裝的膠原的自噬降解。

由于先前的一項研究已經證明了化學伴侶通過減輕蛋白質錯誤折疊來減少由COL4A2突變引起的患者原發性真皮成纖維細胞中細胞內膠原積累和內質網應激的潛力，研究人員研究了類似的方法是否可以逆轉由AS COL4A5突變引起的腎類器官中觀察到的一些異常。

為了驗證這一點，他們用幾種低分子量化學伴侶，4-苯基丁酸(4-PBA)，三甲胺n -氧化物(TMAO)和甘露醇處理輕度AS腎類器官，并觀察到α5(IV)膠原蛋白在4-PBA處理的突變GBM樣結構中，從而突出其作為AS治療的可行治療策略的潛力。

總之，這項合作努力成功地產生了一個體外疾病模型，以再現AS病理的幾個關鍵方面。有了這個新的實驗系統，研究人員現在可以闡明這種使人衰弱的疾病的詳細致病機制，并預測對新療法的治療效果。

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