科學家開發(fā)出高通量檢測單細胞mRNA動態(tài)變化的新技術scNT-seq

　　細胞命運轉變以及響應外界信號的過程中會改變細胞類型特異（cell-type-specific）的基因表達，而基因表達的豐度(total RNA level)是由mRNA轉錄、加工、降解等過程共同決定的。

　　在含有多種細胞類型的復雜組織和系統(tǒng)中，在單細胞水平準確測定這些 mRNA動態(tài)變化過程對于理解基因表達調控的重要性不言而喻。

　　傳統(tǒng)的mRNA代謝標記技術利用尿苷類似物4-硫尿苷（4sU）可以有效的標記新生mRNA，但是技術上的局限性不能達到單細胞分辨率；而常規(guī)單細胞轉錄組測序技術雖然可以揭示不同細胞類型的穩(wěn)態(tài)轉錄組，但是不能精確分辨特定時間里新生成的和已有的mRNA，因此用于定量研究細胞類型特異的mRNA動態(tài)調控機制十分困難。

　　為了應對這一挑戰(zhàn)，美國賓夕法尼亞大學吳昊實驗室開發(fā)了一種高通量檢測單細胞mRNA動態(tài)變化的新方法， scNT-seq（全稱single-cell metabolically labeled new RNA tagging sequencing）。

　　該方法創(chuàng)新性的整合了mRNA代謝標記 (metabolic labeling)，基于液滴微流控（droplet microfluidics）的高通量單細胞轉錄組分析技術和最近開發(fā)的4sU化學轉化反應 （chemically recode 4sU to cytosine analog）；在數(shù)據(jù)分析方面，作者構建了基于unique molecular identifier (UMI) 的統(tǒng)計模型來更加準確地分析單細胞水平上新生成的mRNA的比例。

　　北京時間2020年8月31日晚23時，Nature Methods雜志在線發(fā)表了文章 “Massively parallel and time-resolved RNA sequencing in single cells with scNT-seq”。

　　作者應用這一技術解析了小鼠神經(jīng)元快速激活過程中的單細胞基因調控網(wǎng)絡并預測細胞狀態(tài)變化軌跡，他們還進一步研究了不同胚胎干細胞狀態(tài)轉換過程中的mRNA動態(tài)變化的調控機制。

　　scNT-seq具體技術流程如下：首先將4sU添加到培養(yǎng)基中用來標記細胞中新生成的mRNA（圖1第1步）。為了在單細胞轉錄組中區(qū)分含有4sU標記的轉錄本，將4sU化學轉化反應整合到液滴微流控 (Drop-seq) 流程中（圖1第2-4步）。

　　由于捕獲mRNA的barcoded beads具有區(qū)分不同轉錄本的UMI序列，相比較沒有UMI的單細胞分析技術（e.g. scSLAM-seq），該方法不僅可以消除由于PCR擴增帶來的誤差，而且相對于單個mRNA分子而言能增加T-to-C的覆蓋度（圖1第5-8步）。

　　最后，利用基于UMI的二項式混合分布來準確估計每個細胞中單個基因的新生轉錄本。（圖1第9步）

　　圖2 利用scNT-seq技術研究小鼠大腦皮層神經(jīng)元中神經(jīng)活性調控的轉錄動態(tài)。

　　前人的研究表明，神經(jīng)元激活后可以快速誘導（幾分鐘到幾小時內）幾百個特異基因表達，這些基因被稱為神經(jīng)活性調節(jié)的基因（Activity-regulated genes， ARGs）。

　　利用ARGs被神經(jīng)活性快速誘導而在靜息狀態(tài)下幾乎不表達的特點，可用其評估scNT-seq技術檢測新生成mRNA的可靠性。作者用4sU標記原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)細胞，其間用氯化鉀（KCl）激活這些細胞（15-120分鐘）（圖2a）。

　　作者首先將大腦皮層神經(jīng)元聚類成不同細胞類型，包括興奮性神經(jīng)元（Ex）、抑制性神經(jīng)元 (Inh)、神經(jīng)元前體細胞（NP）等（圖2b）。接下來他們分析了不同細胞類型中，ARGs基因中（如Jun和Npas4基因，圖2c）新（new RNAs，產(chǎn)生于4sU標記的2小時內）和舊（old RNAs，產(chǎn)生于2小時前）轉錄本在不同細胞類型中的表達水平。

　　這些ARGs的new RNAs在不同細胞類型中有不同程度的響應，而old RNAs沒有明顯響應（合成于4sU標記和神經(jīng)元激活前），說明scNT-seq可以準確區(qū)分新舊轉錄本。

　　在準確區(qū)分新、舊轉錄本的基礎上，作者運用新近開發(fā)的Dynamo算法程序在興奮性神經(jīng)元中進行了基于mRNA代謝標記的RNA velocity分析（圖2d右側），能準確捕獲神經(jīng)元激活早期（0 – 15min）和晚期（30 – 120 min）的變化。

　　相較之下，傳統(tǒng)的RNA velocity利用已拼接（無內含子）和未拼接（有內含子）的轉錄本信息來間接地預測細胞中基因表達的變化趨勢。

　　由于Jun， Fos等早期響應基因內含子長度較短，基于內含子/外顯子定量的傳統(tǒng)RNA velocity方法無法準確估計這些基因的動態(tài)變化，因此無法鑒定到神經(jīng)元激活早期（0 – 15min）的變化 (圖2d左側）。

　　而基于新生成轉錄本的RNA velocity能夠直接利用實驗準確定量的新、舊轉錄本的信息，推測mRNA的動態(tài)變化，不受基因結構（內含子比例）影響，兼具準確性和適用性。

　　細胞中RNA的豐度由轉錄、加工、降解等過程共同決定，準確測定細胞群體中稀有或動態(tài)變化的細胞類型中mRNA合成和降解速率是一個重要而充滿挑戰(zhàn)的問題。

　　前人的研究表明，小鼠胚胎干細胞存在不同的干細胞狀態(tài)，其中大約1%的細胞會自發(fā)轉變?yōu)榫哂懈叻只瘽摿Γ╰otipotent）的“2C-like”狀態(tài)（2-cell embryos like state）。

　　作者通過pulse-chase的標記策略結合scNT-seq技術測定了2616個基因在不同細胞狀態(tài)中的降解速率（half-life，圖3a，b）。

　　結合4小時4sU標記實驗，作者測定了445個差異表達基因的合成和降解速率。根據(jù)mRNA合成速率和降解速率在不同細胞狀態(tài)間變化的趨勢，這些基因可以劃分為3種不同的mRNA豐度調節(jié)策略（圖3c）。

　　有意思的是，即使采用同一種調控策略的基因，mRNA合成和降解對于不同基因mRNA豐度調節(jié)的貢獻也不盡相同。例如Tet1和Lefty2基因都采用“Destabilizing”策略（mRNA合成和降解速率同向變化），但是Tet1基因主要通過降低合成速率（synthesis rate）降低2C-like細胞中mRNA豐度，而Lefty2基因主要通過提高降解速率（degradation rate）降低2C-like細胞中mRNA豐度（圖3c）。

　　總的來說，scNT-seq是一種能在單細胞水平準確定量新生轉錄本的新技術。和已有的單細胞代謝標記分析方法[ref 3]相比，這項新技術兼具高準確度，高通量和低成本等優(yōu)勢。

　　因此，scNT-seq與Jay Shendure實驗室的曹俊越博士新近開發(fā)的sci-fate技術，都能夠廣泛應用于分析大量單細胞在細胞命運決定和分化，外界信號響應，及疾病模型等動態(tài)過程中mRNA表達調控等相關的重要生物學問題。