研究發(fā)現(xiàn)新的AAV CRISPR篩選方法，促進(jìn)致病基因的研究

蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院（ETH Zurich）領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)利用腺相關(guān)病毒（AAV）開發(fā)出一種用于體內(nèi)CRISPR篩選的新平臺(tái)，有助于更好地了解致病基因及其在各種細(xì)胞中的表型。

研究人員于9月20日在《Nature》雜志上發(fā)表了這一新成果。他們將這種名為AAV-Perturb-seq的技術(shù)應(yīng)用在小鼠模型中，以了解DiGeorge綜合征相關(guān)基因的表型。

DiGeorge綜合征又被稱為22q11.2微缺失綜合征，由22號(hào)染色體上一個(gè)小片段的缺失引起。發(fā)病率大約為1/4000，通常會(huì)導(dǎo)致心臟問題、免疫缺陷和認(rèn)知問題等癥狀。

研究人員指出，目前的CRISPR篩選方法主要使用慢病毒，**于體外應(yīng)用，而且只適用于這種病毒可以感染的組織。他們認(rèn)為，迫切需要適用于不同組織的體內(nèi)單細(xì)胞篩選，這也是他們選擇AAV的原因，因?yàn)?/span>AAV可以靜脈注射，靶向更大范圍的組織和細(xì)胞類型。

“AAV-Perturb-seq讓人們有機(jī)會(huì)直接分析同一動(dòng)物體內(nèi)多個(gè)細(xì)胞類型中的多個(gè)基因，而不受組織或發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的限制，為研究體內(nèi)的健康和病變過程提供了更多可能，”作者寫道。

研究人員首先創(chuàng)建了一個(gè)AAV向?qū)?/span>RNA（gRNA）文庫，其重點(diǎn)是位于人類22q11.2基因座內(nèi)并在小鼠基因組中高度保守的基因。他們鑒定出29個(gè)在成年小鼠皮層中表達(dá)的基因，并為其設(shè)計(jì)了gRNA序列。

接下來，他們將含有g(shù)RNA的重組AAV注射到LSL-Cas9小鼠中，并在三周后采集大腦樣本。他們從各個(gè)細(xì)胞分離出細(xì)胞核后開展聚類分析，結(jié)果顯示AAV感染了小鼠的神經(jīng)元和非神經(jīng)元腦細(xì)胞。

他們的分析結(jié)果表明，對(duì)于22q11.2缺失小鼠模型，DGCR8、DGCR14、GNB1L和UFD1L基因的擾動(dòng)解釋了大約40%的轉(zhuǎn)錄變化。然而，這些基因無法解釋DiGeorge綜合征患者為何容易患上神經(jīng)發(fā)育和精神疾病。

盡管人們對(duì)每個(gè)基因在成熟腦細(xì)胞中的功能知之甚少，也從未開展過系統(tǒng)研究，但研究人員發(fā)現(xiàn)，DGCR14和GNB1L與成人神經(jīng)元病理學(xué)之間存在關(guān)聯(lián)。

“總的來說，我們的結(jié)果表明，DGCR8、DGCR14和GNB1L可能對(duì)22q11.2微缺失綜合征有影響，它們通過調(diào)控成熟神經(jīng)元的RNA廣泛改變體內(nèi)與疾病易感性相關(guān)基因的表達(dá)，”作者總結(jié)道。

作者表示，下一步他們將確定在發(fā)育期間或之后恢復(fù)DGCR8、DGCR14、GNB1L和UFD1L的表達(dá)是否能挽救與22q11.2微缺失綜合征相關(guān)的神經(jīng)元和認(rèn)知表型。

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